虫害一直是制约棉花产业健康发展的关键因素。传统棉花抗虫分子育种策略主要是是将外源苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)杀虫蛋白基因导入棉花基因组，来增强棉花的抗虫性。虽然这种方法暂时缓解了虫害带来的压力，但是随着Bt棉的长期种植，Bt蛋白的目标害虫-棉铃虫、红铃虫等逐渐进化出抗性，并且Bt蛋白的抗虫谱狭窄对刺吸式口器害虫-蚜虫、蓟马、盲蝽蟓等几乎没有效果。随着新疆棉区蚜虫、蓟马等Bt非靶标虫害加剧，寻找新的抗虫基因并培育新的广谱抗虫品种成为当下棉花生产的重大产业需求。
近日，华中农业大学棉花遗传改良团队金双侠课题组在植物学权威期刊Plant Communication上发表了题为“CRISPR/Cas9-mediated generation of a mutant library of cottonCDPKgene family for identifying insect-resistant genes”的研究文章。他们开发了一种基于CRISPR/Cas9技术创造CDPK基因饱和突变体库的技术体系，利用该突变体库筛选到棉花内源抗虫基因并解析其抗虫机制。
钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)是一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛分布于植物多个组织和细胞器中，在植物的多个生命过程都扮演了重要的角色。其中，CDPK在植物响应植食性昆虫攻击的信号转导网络中起着重要作用。先前的研究证明，来自不同物种的多个CDPKs可以通过调节基因表达或激素信号转导来调节植物对植食性昆虫的抗性。
基因编辑技术为破译基因功能提供了强大工具，而基因组测序的发展有效推动了基因编辑工具的使用。由于其简单的设计，CRISPR/Cas9可以靶向整个基因组中的大部分DNA序列片段，从而可以快速构建大规模的敲除突变文库进行基因功能筛选。因此，基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建突变库的高通量功能缺失筛选已迅速应用于植物。比如基于CRISPR突变体库对番茄、水稻、大豆和玉米进行了功能基因筛选，这些研究已经充分地证明了CRISPR饱和突变筛选的有效性。
本研究首先通过对GhCPKs基因家族进行综合分析，在陆地棉基因组中鉴定出82个GhCPKs，并预测该基因家族参与棉花的多个生命过程，为GhCPKs家族的功能分析奠定基础。接下来，通过246个靶向82个GhCPKs和41对同源GhCPKs的sgRNA混池建库技术，构建了GhCPKs基因家族的饱和突变体库，总共获得了518个独立的T0突变体。靶基因覆盖率达86.18%，平均基因编辑率达89.49%。然后，通过田间表型鉴定结合抗虫实验，筛选出14个抗虫或感虫突变体。最后选择抗虫表型最明显的棉花品系cpk33/74（同时敲除同源基因GhCPK33和GhCPK74）进行进一步研究，并对筛选出的候选抗虫基因GhCPK33和GhCPK74的抗虫机制进行了初步探讨。GhCPK33和GhCPK74共同负调控斜纹夜蛾口腔分泌物诱导的棉花叶片茉莉酸含量的增加与叶肉细胞Ca2+内流，并影响了S -腺苷蛋氨酸合成酶( SAMS)基因的表达，从而增强了突变体cpk33/74的抗虫性。该研究为构建多倍体植物基因家族突变体库提供了有效的策略，并为CDPKs在植物-昆虫相互作用中的作用提供了有价值的见解。此外，大量的突变体为CDPKs的功能研究和棉花抗虫种质提供了宝贵的遗传资源。
GhCDPKs基因家族突变文库构建示意图
GhCPKs基因家族突变文库分子检测及抗虫筛选示意图
GhCPKs突变体库抗虫突变体鉴定
抗虫基因GhCPK33和GhCPK74作用机制解析
据悉，这是金双侠课题组在基因编辑工具开发和分子育种应用方面的又一新进展。前期该课题组开发了Cas9, Cas12a, Cas12b, CBE, ABE, ABE8e, dCas9-TV, Cas13a等工具，能够在靶标位点进行敲除、敲入、敲高、敲低以及SNP点突变等精准修饰，利用这些工具创制了棉籽无棉酚、高油酸、除草剂抗性、抗虫、彩色棉花等优异新种质，为棉花功能基因组研究和分子设计育种提供了完备的工具箱和技术体系。
华中农业大学王福秋博士与黄淮学院梁思佳博士为本论文共同第一作者，华中农业大学金双侠教授，河南大学高巍教授、龙璐教授，新疆农业科学院核生物技术研究所李波研究员为论文的共同通讯作者，闵玲教授、张献龙院士参与了本项目的设计和指导。博士许忠平、王冠英、王琼琼，研究生扶春阳、樊益博、车莲莲、胡天域等参与了该项研究工作。
