近日，我校张献龙教授领衔的棉花团队在Genome Biology杂志上发表了题为“Single-cell resolution analysis reveals the preparation for reprogramming the fate of the plant stem cell niche in lateral meristems”的研究论文。该文用Jin668和不可再生材料TM-1为实验对象，结合单细胞测序技术在单细胞层面解析棉花的体细胞胚胎发生机制，通过对不同再生能力材料的对比，挖掘到决定体细胞胚胎发生能力的关键基因并构建了棉花体细胞胚胎发生的基因调控网络。

高等植物的体细胞再生方式主要有器官发生和体细胞胚胎发生，通过农杆菌介导遗传转化并体细胞胚胎发生或器官再生目前是获得转基因植物的主要方式。棉花是典型的通过体细胞胚胎发生途径实现植株再生的作物，是研究体细胞胚胎发生过程的经典模型。棉花的体细胞培养、植株再生过程非常耗时且是高度基因型依赖的，目前只有少数棉花品种（基因型）能够通过组织培养获得体细胞再生植株。如何提高棉花的体细胞再生效率、打破基因型依赖性是亟待解决的问题。Jin668是团队近年来选育的优良遗传转化受体材料，而其高转化效率和高再生能力背后的基因调控机制仍然未知。研究发现，不同的细胞类型可重编程能力不同。因此，在单细胞水平上准确分析体细胞重编程的过程，对于加深对植物再生调控机制的解析，挖掘决定植物再生能力的关键“密码”，打破棉花再生的基因型限制，具有重要的理论和实践价值。

在农杆菌介导的以棉花下胚轴为外植体的转化过程中，农杆菌主要侵染初生维管组织。体细胞经过脱分化形成愈伤组织是体细胞胚胎发生的关键步骤，棉花下胚轴对于激素诱导的响应十分迅速，在诱导3天后下胚轴两端膨大，诱导7天后部分细胞已经完成脱分化产生愈伤组织。因此，团队选择在培养基上诱导0、1h、6h、12h的Jin668和TM-1下胚轴进行单细胞取样，根据marker基因的表达情况，最终确定7种主要的细胞类型。

图1 GFP和RFP报告基因在棉花下胚轴初生维管组织表达

图2 棉花转化受体-下胚轴细胞类型鉴定

Jin668和TM-1的细胞类型具有高度的一致性，团队发现与生长素、细胞分裂素和伤口诱导相关的基因在初生维管组织细胞类型，包括初生木质部，薄壁组织和形成层细胞中表达，因此推测分化程度较低的细胞类型对激素的诱导更加敏感，是愈伤组织形成的主要细胞类型。为进一步了解细胞命运向胚胎命运转变背后的分子机制，团队对这两个品种的相同细胞类型的基因表达情况进行了分析。研究发现，首先，在初生木质部、形成层和薄壁细胞中鉴定到许多和再生相关的差异基因（DEGs），这些差异基因在Jin668和TM-1中有不同的表达模式——很多体细胞胚胎发生相关的基因在可再生材料Jin668中上调表达，而在TＭ-1中下调表达。其中，维持生长素极性分布的基因以及生长素内流相关基因AUX/LAX在Jin668的形成层和薄壁组织细胞中特异表达，而一些生长素外流的基因在这些细胞类型中下调表达，这表明生长素的分布和极性转运对于细胞的脱分化和再分化有重要作用。

图3 Jin668和TM-1相同细胞类型中的差异表达基因

拟时序分析结果发现，Jin668和TM-1的细胞有不同的生长素分布模式。和TM-1相比，Jin668初生木质部细胞有明显的生长素极性建立，更容易脱分化形成愈伤组织。同样，RNA速率结果表明，TM-1的初生木质部细胞更倾向于分化为根细胞类型而不是形成愈伤组织。以上结果表明，在棉花下胚轴体细胞胚胎发生过程中，初生维管组织细胞是形成愈伤组织的主要细胞类型，生长素是影响细胞去分化的主要因素，生长素的极性转运决定了细胞获得胚胎的能力。此外，不同细胞类型之间的细胞通讯也影响细胞的去分化。在这个过程中，一些决定性的基因影响愈伤组织的诱导和体细胞胚胎的形成。最后，团队通过敲除和过表达实验验证了生长素转运相关基因LAX2影响愈伤组织诱导并能提高胚性愈伤的形成。

本论文得到国家自然科学基金、湖北洪山实验室重点项目资助。博士研究生朱相潜和博士后许忠平为论文共同第一作者，我校张献龙教授和金双侠教授为论文共同通讯作者，杨细燕教授、涂礼莉教授，袁道军副教授、李波研究员、英国杜伦大学Keith Lindsey 教授等参与了本项研究。

【英文摘要】

Somatic embryogenesis is a major process for plant regeneration. However, cell communication and the gene regulatory network responsible for cell reprogramming during somatic embryogenesis are still largely unclear. Recent advances in single-cell technologies enable us to explore the mechanism of plant regeneration at single-cell resolution.

We generate a high-resolution single-cell transcriptomic landscape of hypocotyl tissue from the highly regenerable cotton genotype Jin668 and the recalcitrant TM-1. We identify nine putative cell clusters and 23 cluster-specific marker genes for both cultivars. We find that the primary vascular cell is the major cell type that undergoes cell fate transition in response to external stimulation. Further developmental trajectory and gene regulatory network analysis of these cell clusters reveals that a total of 41 hormone response-related genes, including LAX2, LAX1, and LOX3, exhibit different expression patterns in the primary xylem and cambium region of Jin668 and TM-1. We also identify novel genes, including CSEF, PIS1, AFB2, ATHB2, PLC2, and PLT3, that are involved in regeneration. We demonstrate that LAX2, LAX1 and LOX3 play important roles in callus proliferation and plant regeneration by CRISPR/Cas9 editing and overexpression assay.

This study provides novel insights on the role of the regulatory network in cell fate transition and reprogramming during plant regeneration driven by somatic embryogenesis.

原文链接：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-023-03032-6